2023/4/23
[466]
苯并芘（BaP）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒
使用說(shuō)明書
本試劑盒僅供研究使用。
1 使用目的：
本試劑盒用于奶油，雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣，植物油中苯并芘（BaP）殘留的定量檢測(cè)。
2 實(shí)驗(yàn)原理
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔板包被有苯并芘（BaP）偶聯(lián)抗原，加入苯并芘（BaP）標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，游離苯并芘（BaP）與微孔條上預(yù)包被的苯并芘（BaP）偶聯(lián)抗原互相競(jìng)爭(zhēng)抗苯并芘（BaP）抗體酶標(biāo)記物，用TMB底物顯色，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下進(jìn)行檢測(cè)，吸光值與樣品中苯并芘（BaP）含量成反比，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中苯并芘（BaP）的含量。
3 試劑盒組成
1. 預(yù)包被的苯并芘（BaP）偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1塊（12孔×8條）。
2.苯并芘（BaP）標(biāo)準(zhǔn)品：6瓶（1ml/瓶），含量分別是： 0 ppb，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1 ppb。
3.抗苯并芘（BaP）抗體酶結(jié)合物：1瓶（6ml）。
4.顯色液A：1瓶（6ml）。
5.顯色液B：1瓶（6ml）。
6.終止液：1瓶（6ml），2M硫酸。
7.樣本稀釋液：1瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用。
8.濃縮洗滌液：1瓶（20×，20ml），用于洗板。
9.說(shuō)明書一份。
4 需要而未提供的材料
1.設(shè)備
2.波長(zhǎng)450nm酶標(biāo)儀。
3.粉碎機(jī)。
4.量筒。
5.振蕩器。
6.漏斗。
7.Whatman No 1或相當(dāng)?shù)臑V紙。
8.微量移液器。
9.試劑
10.去離子水或蒸餾水。
11.甲醇。
5 貯存
試劑盒貯存于2~8℃，切勿冷凍 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存
6 注意事項(xiàng)
1.使用試劑盒前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說(shuō)明書。
2.不要使用過(guò)期試劑盒。
3.試劑盒使用前，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時(shí)。
4.標(biāo)準(zhǔn)品中含有苯并芘（BaP），使用時(shí)應(yīng)特別注意，操作時(shí)應(yīng)帶手套。
5.終止液中含有硫酸，使用時(shí)防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。
6.不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不能混用，否則會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果。
7.不同批號(hào)試劑盒中的試劑不得混用；不同標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所用吸頭不得混用，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
8.稀釋樣本時(shí)必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果
9.混合試劑時(shí)應(yīng)避免起泡。
7 工作液準(zhǔn)備
1.苯并芘（BaP）標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb
2.濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20(1+19)稀釋備用
3.樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋備用
4.顯色劑：已備用，避免光線直照
5.反應(yīng)終止液：已備用
8 樣品處理程序（樣品在提取過(guò)程中，要嚴(yán)格按說(shuō)明書操作，提取過(guò)程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋，否則會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）
1.取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液
2.強(qiáng)力振蕩3分鐘
3.用Whatman No 1濾紙過(guò)濾
4.取25µl處理后的樣品，加入25µl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）
9 酶免分析步驟
1. 實(shí)驗(yàn)須知
2.實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前請(qǐng)將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃），時(shí)間約2小時(shí)。回溫至室溫（25±2℃）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存
注：一定保證回溫充分，否則影響檢測(cè)的精確度和準(zhǔn)確度。
3.使用后請(qǐng)立即將試劑放回2~8℃保存
4.請(qǐng)不要改變分析程序
5.請(qǐng)使用精確的微量移液器
6.操作一旦開(kāi)始，請(qǐng)不要中斷任何程序
7.ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序，請(qǐng)嚴(yán)格按照要求操作
8.為避免交叉污染，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣
9.加樣時(shí)請(qǐng)勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面
分析步驟
1.預(yù)先進(jìn)行編號(hào)，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置，推薦進(jìn)行雙孔檢測(cè)
2.取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存
3.樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液(蒸餾水或去離子水稀釋)
4.在B0孔中加入50µl 0.0 ppb標(biāo)準(zhǔn)品溶液
5.在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液
6.在各樣品孔中加入50µl樣品溶液
7.在所有孔中加入50µl的抗苯并芘（BaP）抗體酶結(jié)合物
8.輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板幾秒鐘。
9.37℃溫浴30min （溫浴過(guò)程中不時(shí)輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）
10.甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次，最后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以完-全除去孔中液體。
11.反應(yīng)
12.洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個(gè)微孔中先加入50µl顯色液A，再加 50µl顯色液B；輕微晃動(dòng)反應(yīng)板使之徹-底混勻
13.37℃溫浴10min
14.每孔中加入50µl終止液，混勻
15.在450nm下檢測(cè)吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
10 結(jié)果計(jì)算
1.定量分析
2.所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
3.以苯并芘（BaP）濃度的對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對(duì)應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為苯并芘（BaP）濃度的對(duì)數(shù)值，求得反對(duì)數(shù)即為測(cè)定液中苯并芘（BaP）濃度C（ppb）
4.由于樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數(shù)。
5.半定量測(cè)定
6.目測(cè)半定量測(cè)定： 首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
7.儀器半定量測(cè)定：首先選擇一個(gè)適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。
11 特異性
物質(zhì) 交叉反應(yīng) 苯并芘（BaP） 100%
12 試劑盒參數(shù)
本試劑盒檢測(cè)下限為0.05ppb
B0吸光度最佳值應(yīng)大于1.0
試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％。
用本說(shuō)明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％。
試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb。
14 分析限制
本試劑盒檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證。
